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B) 欠失
口の部分を欠失させる場合
部位特異的変異導入の実際
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACITGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAてCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5'
* 欠失を行う
のより正確なPCR用DNAポリメラーゼを使う
2変異の入ったPCR用プライマーの設計
変異を入れたいところを中心に、前後の広い範囲の
塩基配列(相補鎖も)を書き出す。
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACIGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTG|CTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5
オーバーラップ領域を15 base 選定する。
(変異部分をなるべく中心にする)
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGAC|GAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTG|CTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5'
* 変異部分 から 18 base 3" 側に伸ばす。
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGAC|GAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTG|てTTTTGGGACてGてAATGGGTTG-5'
部分を削除して、プライマー配列とする
5-TCGTGAC「GAAAACCCTGGCGTTACC-3"
プライマー内部の塩基配列を変えることで、終止コドン
挿入やアミノ酸の置換、欠失や挿入が可能
A) 置換
3-CAAAATGTTCGAGCACTG|TTTTTGGG-5"
*欠失のサイズに制限はありません。
タカラバイオのキットのマニュアルより
図3B. 欠失変異のためのプライマー設計
GAC」の部分を TGA に置換する場合
C) 挿入
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5'
* 置換を行う
|の部分に(CTCGAG)を挿入する場合
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCAACT|ACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5'
GGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3"
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGAC1
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGA|CCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5'
オーバーラップ領域を15 base 選定する。
(変異部分をなるべく中心にする)
* Insertion を行う
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCAACT|ACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5'
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTCTCGAGGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTC|CCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5'
* 変異部分 口から 18base 3"側に伸ばす
オーバーラップ領域を15 base 選定する。
(変異部分をなるべく中心にする)
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3"
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCAACTACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5"
部分を削除して、プライマー配列とする
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTCTCGAGGGGAAAACCCCTGGCGTTACCCAAC-3'
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTC|CCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5"
* 変異部分 から 18 base 3'側に伸ばす
5-CGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTT-3'
3-CAGCAAAATGTTCGAGCAACTACCCTT-5"
5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTCTCGAGGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3"
3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTCてててTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5"
*1~15塩基の置換が可能です。
部分を削除して、プライマー配列とする
図3A.置換変異のためのプライマー設計
5-GACTCTCGAGGGGAAAACCCTGGCGTTA-3'
3-AAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTCてててTT-S"
*1~15塩基の挿入が可能です。
この場合は終止コドンだが、任意のコドンに変換して
対応するアミノ酸に置換することが可能
図3C. 挿入変異プライマーの設計
課題0-5 図AのGACはASP(アスパラギン酸)のコドンである。ここを下記のアミノ酸に置換する時の塩基配列を記せ
1) Met、2)Trp、3) His (2種類あり)
コドン表は第8回の資料を参照し、 DNA配列で回答すること(UはT)。
