B) 欠失 口の部分を欠失させる場合 部位特異的変異導入の実際 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACITGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAてCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5' * 欠失を行う のより正確なPCR用DNAポリメラーゼを使う 2変異の入ったPCR用プライマーの設計 変異を入れたいところを中心に、前後の広い範囲の 塩基配列(相補鎖も)を書き出す。 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACIGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTG|CTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5 オーバーラップ領域を15 base 選定する。 (変異部分をなるべく中心にする) 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGAC|GAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTG|CTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5' * 変異部分 から 18 base 3" 側に伸ばす。 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGAC|GAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTG|てTTTTGGGACてGてAATGGGTTG-5' 部分を削除して、プライマー配列とする 5-TCGTGAC「GAAAACCCTGGCGTTACC-3" プライマー内部の塩基配列を変えることで、終止コドン 挿入やアミノ酸の置換、欠失や挿入が可能 A) 置換 3-CAAAATGTTCGAGCACTG|TTTTTGGG-5" *欠失のサイズに制限はありません。 タカラバイオのキットのマニュアルより 図3B. 欠失変異のためのプライマー設計 GAC」の部分を TGA に置換する場合 C) 挿入 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5' * 置換を行う |の部分に(CTCGAG)を挿入する場合 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCAACT|ACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5' GGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3" 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGAC1 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGA|CCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5' オーバーラップ領域を15 base 選定する。 (変異部分をなるべく中心にする) * Insertion を行う 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCAACT|ACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5' 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTCTCGAGGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTC|CCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5' * 変異部分 口から 18base 3"側に伸ばす オーバーラップ領域を15 base 選定する。 (変異部分をなるべく中心にする) 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3" 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCAACTACCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5" 部分を削除して、プライマー配列とする 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTCTCGAGGGGAAAACCCCTGGCGTTACCCAAC-3' 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTC|CCCTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5" * 変異部分 から 18 base 3'側に伸ばす 5-CGTCGTTGATGGGAAAACCCTGGCGTT-3' 3-CAGCAAAATGTTCGAGCAACTACCCTT-5" 5-CGTCGTTTTACAACGTCGTGACTCTCGAGGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAAC-3" 3-GCAGCAAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTCてててTTTTGGGACCGCAATGGGTTG-5" *1~15塩基の置換が可能です。 部分を削除して、プライマー配列とする 図3A.置換変異のためのプライマー設計 5-GACTCTCGAGGGGAAAACCCTGGCGTTA-3' 3-AAAATGTTCGAGCACTGAGAGCTCてててTT-S" *1~15塩基の挿入が可能です。 この場合は終止コドンだが、任意のコドンに変換して 対応するアミノ酸に置換することが可能 図3C. 挿入変異プライマーの設計 課題0-5 図AのGACはASP(アスパラギン酸)のコドンである。ここを下記のアミノ酸に置換する時の塩基配列を記せ 1) Met、2)Trp、3) His (2種類あり) コドン表は第8回の資料を参照し、 DNA配列で回答すること(UはT)。